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美丽帽柱木（Mitragyna speciosa）俗称卡痛树，属于茜草科帽蕊木属植物。低剂量食用卡痛叶会产生刺激作用，而高剂量会产生镇痛作用。卡痛叶具有悠久的药用历史，可用于对抗疲劳，也可用于治疗疼痛﹑抑郁症以及减轻阿片类药物戒断症状。由于卡痛叶出色的镇痛效果以及娱乐用途，在世界范围内被越来越多的人使用。卡痛叶显著的药理活性与所含生物碱类化合物密切相关，从中已经发现了包括柯楠因型和氧化单萜吲哚类生物碱共50余种。值得注意的是，其特征且主要的生物碱成分帽柱木碱mitragynine（1）及其衍生物7-OH mitragynine均为μ-阿片受体的强效激动剂，在小鼠体内显示出比吗啡强10倍的镇痛效果，但其C-20位差向异构体speciogynine（3）是一种平滑肌松弛剂，并未显示出镇痛活性（图1）。1和3不同的生物活性凸显了卡痛生物碱C-20构型的重要性。因此，阐明帽柱木碱的生物合成及C-20构型差异形成机制，对于其生源途径解析及活性成分结构改造具有重要的现实意义，并为酶法生产帽柱木碱及其异构体等提供科学依据。

Strictosidine (8)是大部分单萜吲哚生物碱的共同前体，可以在strictosidine 去糖基化酶（SGD）的作用下脱去葡萄糖产生中间体4，接着在还原酶的催化下还原成多种异构体，其中dihydrocorynantheine (11a和11b)具有与1和3相同的骨架，可能是合成1和3的中间体。在奎宁生物碱生物合成途径中，药用植物金鸡纳（Cinchona pubescens）的还原酶CpDCS能够催化11b的产生。作者利用同源序列比对，挖掘卡痛中的相关基因，发现有两个还原酶MsDCS1和MsDCS2均能产生20R-dihydrocorynantheine (11b)，并且MsDCS1还大量产生了与11b具有不同保留时间的C-20位差向异构体20S-dihydrocorynantheine (11a)（图2）。通过与MsDCS1进行共表达分析，筛选得到11a/11b转化为corynantheidine 5a/5b的烯醇甲基转移酶基因MsEnolMT，并在烟草中验证。有趣的是，虽然1和3主要在卡痛的叶和茎中积累，但其生物合成酶MsDCS和MsEnolMT主要在根中表达。

为理解MsDCS1如何控制C-20的立体选择性，作者构建了还原酶MsDCS1、MsDCS2和CpDCS的结构模型，并把辅因子NADPH和底物对接到酶中。和CpDCS相比，MsDCS活性口袋中有七个氨基酸（T53, I100, N116, S295, G296, A297和S298）是不同的。通过将MsDCS中四个氨基酸定点替换成CpDCS的氨基酸（SGAS295-298ATGG），20S构型的产物11a从原先的74%减少到35%；进一步把所有七个关键氨基酸进行替换，11a只剩下5%，实现了产物的构型翻转（图3）。

帽柱木碱1及其异构体3生物合成途径的最后两步涉及corynantheidine 5a/b C-9位的氧化和甲基化，但作者筛选了172个氧化酶候选基因，并未检测到任何产物的生成。为实现帽柱木碱的体内合成，作者利用了突变合成策略。Strictosidine (8)是由secologanin (19)和色胺在strictosidine合成酶 (STR)的催化下缩合而成。在烟草中瞬时表达CrSTR, CrSGD, MsDCS和MsEnolMT,并加入底物19和色胺能够产生5a和5b（图2e）。把上述反应中的色胺替换成氟代色胺（20-22）能够产生氟代5a和5b(23-28); 把色胺替换成4-甲氧基色胺（18），能够在烟草中产生甲氧基化的5a和5b,即实现1和3的体内生物合成，为以后利用代谢工程手段在微生物中生产帽柱木碱及其异构体奠定基础（图4）。

综上，该工作发现了两种还原酶 (MsDCS1和MsDCS2) 以及一种烯醇O-甲基转移酶 (MsEnolMT)，阐明了在卡痛树中产生柯南因型生物碱的关键酶学步骤以及负责控制关键C-20位立体选择性的分子机制。

德国马普所化学生态学研究所Sarah E. O’Connor教授为该文章的通讯作者，课题组Carsten Schotte博士和江寅迪博士为本文共同第一作者。

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