马普所Sarah O'Connor组Nature|士的宁生物合成途径解析

遇见/内容

士的宁分子含有7个环和6个手性中心,是结构最为复杂的天然产物之一,因而对合成化学具有极大的挑战性。其相关研究历史如补充图1所示。

之前研究中通过同位素标记证实类似于其他单萜吲哚生物碱，士的宁生物合成前体来源于色氨酸和GPP，之后转化为关键中间体geissoschizine和Wieland-Gumlich醛6（图1，补充图2）。

本文作者首先选取马钱子属的两个成员，一个已知的士的宁 10生产者S. nux-vomica和一个非生产者Strychnos sp.研究其生物合成途径。S. nux-vomica的代谢分析显示存在几种马钱子生物碱，包括士的宁 10、异马钱宁11、β-colubrine 13和brucine 15，并且主要在根部积累，之后作者进行组织特异性RNA测序以挖掘相关基因，根据三个标准选择候选基因: (1) 在S. nux-vomica 根部高表达; (2) 与推定的上游基因进行共表达; (3) 含有编码具有催化功能蛋白质的基因，并与假设的生物合成途径的化学逻辑一致（图2）。

作者推测中间体2经过酯水解、脱羧反应生物合成6。作者重点关注S. nux-vomica中同源的geissoschizine氧化酶CrGO，以CrGO为探针对S. nux-vomica转录组进行BLAST搜索发现转录簇4032.29856（图2a）。作者通过根癌农杆菌介导的瞬时表达在本氏烟草叶片中表达该基因，发现其可以生成2和3，作者将簇4032.29856命名为SnvGO。

甲酯的脱羧过程可以由酯水解引发，作者推测α/β水解酶水解2的酯基团生成4（图3a）。与SnvGO进行共表达分析，作者选取五种α/β水解酶进行功能表征，其中两个候选簇4032.2064和4032.2781可以生成4，作者将这两种α/β水解酶命名为SnvNS1和SnvNS2（图3b）。

之后作者推测4转化为6需要羟化酶和还原酶分别催化C18羟基化和还原2,16双键。最初作者选取与SnvGO共表达的五种P450酶和四种中链脱氢/还原酶（MDR），经过组合瞬时表达实验实验作者发现所有候选的P450酶和MDR与SnvGO和SnvNS1可以生成6，作者将其分别命名为SnvNO和SnvWS，作者推测SnvWS的催化机理如补充图10所示。

从6生物合成10需要额外引入两个碳原子形成哌啶酮环（G环），经过代谢分析比对，非士的宁生产者Strychnos sp.中主要生成diaboline 8（6的N-乙酰化的产物），因此，作者推测S. nux-vomica和Strychnos sp.应该含有类似的从1到6的生物合成途径（图2c）。对于非生产者转录组的BLAST搜索确定了同源酶SpGO、SpNS1、SpNS2、SpNO和 SpWS，发现其可以催化6的形成。diaboline 8生物合成唯一的剩余步骤是吲哚胺的乙酰化反应，在生物碱生物合成中，通常由BAHD酰基转移酶以乙酰辅酶A作为酰基供体催化酰基转移反应，而在Strychnossp.中SpAT负责催化8的形成。

S. nux-vomica中含有SpAT的同源酶SnvAT，然而S. nux-vomica不生成8，结合之前的喂养研究表明8不是士的宁10的生物合成前体，作者推测SnvAT和SpAT可能具有不同的酶活性，将SnvAT、SnvGO、SnvNS1、SnvNO、SnvWS和1在本氏烟草中同时表达发现在叶子提取物中检测到丙二酰化产物，表明SnvAT是一种具有丙二酰基转移酶活性的BAHD酰基转移酶，作者进一步证实SnvAT负责催化9的形成。随后9可以自发转化为士的宁10和异士的宁11。

Brucine15是士的宁10的二甲氧基化衍生物，也在马钱子的根部高度积累，为鉴定相关羟化酶，作者选取12种与SnvGO具有相对较高共表达的全长P450酶，其中Snv10H可以催化生成10位羟基化的士的宁12，由于存在中间体β-colubrine 13，表明两个甲氧基分别组装的，因此下一步作者鉴定甲基转移酶SnvOMT，之后13在Snv11H和SnvOMT的作用下分别生成14和15（图3c）。最后作者在本氏烟草中从geissoschizine 1 重构士的宁等咔唑类生物碱的生物合成途径（图3d）。

总之，本文作者结合化学合成逻辑、组学分析和酶学实验发现并鉴定士的宁等咔唑类生物碱生物合成的九种关键酶，为未来利用合成生物学异源生物全合成士的宁奠定基础。

遇见/致谢

感谢各位导师和同学对本号的支持，也感谢其他同仁的稿件支持。开设此栏的目的是为了鼓励为公众号做出贡献的人(成员：陶晓花、Huibin、二禾、晓丽、L&Z、Frans、蛋炒饭、刘杰、勋仔、E先生、小萌萌第二声、花小四儿、李元元、秋霖良欣、知识雨、shaw、秋辰、惊蛰-谷雨、李晓凤、姜玥辰、drummer等...名单持续更新中)，他们无私的稿件以及用心的经营，使得本号能够正常规范的运营。在此遇见编辑部感谢他们的努力，也期待更多的同行加入我们，为中国的生物合成研究聚力凝心，做出贡献。加入我们、获取转载权限、投稿、招聘等，请发至公众号邮箱：[email protected]，谢谢！

遇见生物合成编辑部

2022