马普所Sarah E. O'Connor组Nature | 金鸡纳生物碱生物合成途径全解析

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金鸡纳树(Cinchona spp.)，属于龙胆目茜草科金鸡纳属植物，其所产生的金鸡纳生物碱在医学和基础科学中具有里程碑式意义：

图1. 金鸡纳生物碱的生物合成途径

代表性金鸡纳生物碱奎宁Quinine，是人类历史上最重要的抗疟疾药物之一，曾深刻影响全球公共健康，至今仍作为食品添加剂被广泛使用；其立体异构体奎尼丁Quinidine则是一种临床常用的抗心律失常药物，同样具有极高的药用价值；他们的去甲氧基化结构类似物辛可宁Cinchonine、辛可尼丁Cinchonidine则被广泛用作手性催化剂，在工业合成与化学中不可或缺。尽管应用广泛、历史悠久，这类生物碱物质也早已实现了全化学合成，但他们在植物中的生物合成途径一直是未解之谜。尽管这些分子早已实现全化学合成，其在植物体内的天然生物合成途径却始终未明。尤其是其独特的“喹啉–奎宁”双环骨架，长期被视为天然产物生物合成领域的经典未解问题。

图2. 同位素标记实验鉴定关键中间体

此前的研究普遍认为，Corynantheal 型生物碱是金鸡纳生物碱生物合成通路中最后一个可以被明确界定的中间体。然而，作者在对金鸡纳植物代谢特征的进一步分析中发现，该化合物在植物体内极易发生还原反应，生成对应的醇类化合物 Corynantheol。这一现象提示，传统认知中的“末端中间体”可能并非真正参与后续生物合成反应的分子形态。为验证 Corynantheol 是否是通路中的真实中间体，研究团队利用d5-Corynantheol对金鸡纳组织进行喂养实验。结果表明，该标记化合物可以被有效转化为多种下游金鸡纳生物碱，明确证明 Corynantheol具备进入后续生物合成步骤的能力，从而确立了其作为潜在关键中间体的地位。

在这一喂养实验过程中，作者还意外分离得到一种此前未知的代谢产物。通过进一步的“再喂养”实验，研究团队证实该未知化合物能够被继续转化为终产物，表明其并非旁路产物，而是处于主通路上的关键节点。结合分离纯化与化学合成两种手段，作者最终完成了该化合物的结构鉴定，确认其为一种此前未被报道的季铵盐型中间体，并将其命名为 Cinchonium。这一发现加深了对金鸡纳生物碱生物合成路径的理解。

基于 Cinchonium 的结构特征，研究团队提出了一个合理的生物合成假设：从 Corynantheol 向 Cinchonium 的转化，可能需要首先在 Corynantheol 骨架上通过酶促方式引入一个良好的离去基团，随后经由分子内亲核取代反应完成环化，从而构建金鸡纳生物碱中极具标志性的奎宁环结构。围绕这一假设，作者系统筛选了多种转移酶，最终鉴定并表征了一个丙二酰基转移酶CpMAT，其能够高效催化 Corynantheol 的丙二酰化修饰。尽管该丙二酰化中间体在天然植物样品中难以直接检测，作者通过d5-Malonylcorynantheol喂养实验以及CpMAT 的基因沉默（VIGS）实验，从体内与体外两个层面验证了这一修饰在生物合成通路中的功能相关性，为CpMAT及其催化产物在通路中的真实角色提供了有力支持。

图3. 多组学方法鉴定关键环化酶

然而，丙二酰基并非典型的良好离去基团，且该修饰形式在烟草异源表达体系中能够稳定存在，表明后续由离去基团脱除引发的环化反应并非自发进行，而极有可能依赖于特定酶的催化。在针对脱羧酶、氧化酶等常见酶类的筛选未能获得阳性结果后，作者意识到传统基于功能注释的筛选策略已难以奏效，因而转向了一种多层级、跨尺度的联合挖掘方案。具体而言，研究团队首先通过植物叶片单核转录组测序，锁定生物合成活动高度富集的细胞类型；随后结合传统蛋白柱纯化、体外酶反应与蛋白质组学分析，直接从具有催化活性的蛋白组分中反推出候选基因序列；与此同时，作者还引入多种茜草科植物的比较转录组分析，并以拟南芥作为阴性对照，系统剔除进化上高度保守但与目标反应无关的背景基因。通过这一系列互补策略的整合，候选基因数量最终被压缩至仅 20 个。在随后的烟草体系功能验证中，研究团队成功鉴定出一个具有明确催化活性的酶CpMCC。令人意外的是，CpMCC在进化分类上仍属于 BAHD 家族丙二酰基转移酶，但其催化的却并非酰基转移反应，而是脱丙二酰基并诱导环化，功能上与传统 BAHD 酶完全相反。这一发现不仅为奎宁环形成提供了关键酶学证据，也显著拓展了人们对 BAHD 家族酶催化多样性的认识。

在CpMCC 的基础上，作者进一步通过共表达分析，鉴定了一种α-酮戊二酸依赖双加氧酶CpCiS。该酶能够催化形成长期以来仅停留在推测层面的中间体 Cinchonaminal。与既往假设的开链结构不同，研究表明该化合物在植物体内始终以环化的季铵盐形式存在，这是该中间体首次在生物合成、分离纯化和结构鉴定层面得到系统验证。此外，结合卡痛树中吲哚氧化酶的序列信息以及金鸡纳树组织层面的基因表达拟时序分析，作者进一步表征了一个高度同源的细胞色素P450 酶CpCiO。该酶能够催化五元吲哚环向六元喹啉环的一步扩环反应，并通过VIGS实验在植物体内验证了其在生物合成中的关键作用。至此，金鸡纳生物碱最核心的“奎宁–喹啉”双环骨架的形成机制被完整揭示。

在完成核心骨架构建相关酶的鉴定后，作者进一步关注金鸡纳生物碱合成末端的还原步骤。通过共表达分析，研究团队鉴定了一个酮还原酶CpKR4。体外酶学实验表明，CpKR4能够催化多个金鸡纳生物碱终产物的生成，包括奎宁在内，显示出其在生物合成末端反应中的潜在功能。然而，与此前鉴定的多种关键酶不同，CpKR4在烟草异源表达体系中未表现出可检测的体内活性。作者进一步发现，在体外反应体系中加入烟草提取物后，CpKR4的催化活性明显受到抑制，提示烟草中可能存在内源性因子干扰该还原反应的进行。这一现象为CpKR4在异源体系中的失活提供了一种可能解释。值得注意的是，CpKR4在体外体系中除生成天然构型的金鸡纳生物碱外，还会产生一定比例的非天然立体构型产物。由于金鸡纳树叶片中终产物本身含量极低，难以开展有效的 VIGS 验证，作者目前尚无法明确判断这些非天然构型是由体外反应条件导致，还是反映了CpKR4自身底物或立体选择性较弱的特性。因此，研究并不排除在金鸡纳树中还存在一个或多个更高效、且具有更强立体选择性的还原酶，专门负责终产物构型的精确控制。

图4. 金鸡纳生物碱在烟草中的通路重构

基于上述基因鉴定，作者在烟草体系中成功重构完整通路，实现了从商业可得前体 tryptamine 和 secologanin 出发，合成多种下游金鸡纳生物碱。更进一步，通过将 tryptamine 替换为卤代类似物，研究团队成功合成了卤代金鸡纳生物碱衍生物，展示了该通路在结构改造与代谢工程中的巨大潜力。

图5. 非天然卤代金鸡纳生物碱的生物合成

金鸡纳生物碱是天然产物化学史上最为经典、同时也最具现实应用价值的一类分子，其研究跨越了药物化学、有机合成、植物生物学与进化生物学等多个领域。然而，尽管这些化合物在化学合成层面早已被攻克，其在植物体内的生物合成逻辑却长期缺乏系统认识，尤其是独特的“喹啉–奎宁”双环骨架如何形成，一直是天然产物领域的核心未解问题。本研究通过多组学联合、酶学表征与异源表达体系的系统整合，首次在分子层面完整解析了金鸡纳生物碱的生物合成全途径，不仅揭示了多个此前未被预期的反应步骤，还发现了一种由 BAHD 家族酶介导的全新催化模式，显著拓展了人们对植物次生代谢酶功能多样性的认知。在此基础上，研究团队成功在烟草体系中实现了从简单商业前体到底物复杂金鸡纳生物碱的通路重构，并进一步展示了该体系对非天然卤代底物的高度包容性。

这些发现不仅为理解植物如何构建复杂天然产物提供了清晰范式，也为通过代谢工程手段获取金鸡纳生物碱及其结构改造衍生物奠定了坚实基础。更重要的是，该研究将一个被研究了两个多世纪的经典天然产物体系，转化为一个可解析、可重构、可设计的生物合成模型，为未来天然药物的绿色制造与理性改造提供了新的可能。

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